赵志博团队在猕猴桃溃疡病菌致病力演化机制方面取得新进展

致病是病原菌的基本特征。然而，在植物病理学研究中，经常观察到病菌致病性或致病力的变异。例如，在基因对基因理论中，寄主抗病基因对无毒基因的识别可激发强烈的免疫反应，导致致病力“丧失”（Scofield et al., 1996）。然而，一些机制可导致病菌真实丧失了致病性，而非“基因对基因”中寄主强烈免疫作用的结果。例如，在病原真菌核盘菌、病原细菌青枯菌被病毒侵入后，会导致致病力衰退或丧失（Xie & Jiang, 2014; Addy et al., 2012）；土壤杆菌在侵染过程中通过丢失Ti质粒而转变为无致病力类型（Belanger et al., 1995）。此外，许多病原菌在体外传代培养时，也会出现毒力衰退现象，比较典型的例子是青枯菌在传代过程中因全局调控基因phcA发生突变而导致致病力丧失，且此现象在田间也能观察到（Poussier et al., 2003）。这些案例说明，不同病菌丧失致病力的机制可能不同。此外，无致病力菌株对寄主的侵染能力下降、在寄主体内的增殖能力下降，在自然发病的组织中为何会出现不致病变异体、其何去何从是值得思考的问题。

近日，植物病理学权威期刊《Molecular Plant Pathology》（中科院1区Top）在线刊发了植物病理学科赵志博副教授团队题为“Natural variation in the hrpL promoter renders the phytopathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae nonpathogenic”的最新研究成果，研究报道了猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae（Psa）致病力自然丧失的遗传机制，并发现不致病变异体在混合群体中具备生长优势。

研究人员从76个感染猕猴桃溃疡病的果园分离了377个Psa菌株，发现其中来自40个果园的84个分离株丧失了致病力（图1）；对这些不致病变异体的来源进行研究，发现不致病变异体主要来自枝干溃疡组织，而在感染Psa的花和叶很少分离到。

图1猕猴桃溃疡病菌不致病变异体可普遍自然形成

对其中1株无致病力菌株G166进行研究，通过多基因序列分析明确其属于Psa生物型3（图2a-b）。进而发现G166丧失了激发非寄主烟草超敏反应的能力，可能与III型分泌系统（T3SS）缺陷有关（图2c）。进而使用监测T3SS纤毛蛋白HrpA表达水平的荧光素酶报告质粒，在侵染寄主猕猴桃和浸润烟草时进行检测，发现G166不能正常表达HrpA（图2d-f），表明G166中关键致病因子T3SS功能异常。为了探索原因，对T3SS核心调控通路“HrpRS-HrpL-T3SS”的相关基因表达量进行检测，发现G166中hrpR转录水平与致病株无显著差异，但hrpL基因转录水平显著下降（图2g）。

图2 G166致病力丧失与其T3SS功能缺陷有关

在丁香假单胞菌中，由同一操纵子编码的HrpR和HrpS是hrpL的转录增强子。但是，hrpL的转录还受到其它多个基因的调控，例如AefR、CorRS、IHF、PsrA、SetA等。为了解析G166中hrpL转录异常的原因，文章开展了比较基因组学研究，发现G166中这些基因与致病型菌株无差异，但在hrpL的启动子区域鉴定到了1个单碱基插入（图3a）。在G166中表达受野生型启动子控制的hrpL基因，可恢复其激发烟草超敏反应的能力（图3b）和对寄主猕猴桃的致病力（图3c），表明该单碱基插入事件是导致G166丧失致病力的原因。进一步检测发现，G166与致病型菌株的hrpRS启动子活性无差异（图3d），但单碱基插入的hrpL启动子无论在G166中还是在致病型Psa中，启动子活性均显著降低（图3e）。

图3单碱基插入hrpL启动子导致其转录活性降低以及病菌致病力丧失

通过对hrpL启动子序列进行分析，发现该单碱基插入位于“-12/-24”区，可能影响转录过程中σ⁵⁴因子与启动子的接合（图4a）。为了验证该猜测，文章构建了hrpL启动子的生物素标记探针（图4b），在大肠杆菌中表达了σ⁵⁴蛋白（图4c），开展EMSA检测发现单碱基插入的启动子探针与σ⁵⁴蛋白的接合能力显著低于野生型启动子（图4d-e），表明单碱基插入hrpL启动子，导致基因转录过程中其与σ⁵⁴因子接合能力下降、hrpL基因不能正常转录，最终导致依赖T3SS的病菌致病力丧失。

图4单碱基插入hrpL启动子导致其与σ⁵⁴蛋白的结合能力下降

为了检测该自然变异在Psa群体中的发生情况，作者们根据单碱基插入形成新的酶切位点BsaBI建立了PCR-RLFP方法，对84个不致病菌株进行检测，发现另有3株具备相同突变（图5a）。通过基因组重测序验证该突变在这些菌株中均存在（图5b）；这些菌株具有同G166相似表型，且表达hrpL可恢复其依赖T3SS的表型缺陷（图5c-e）；基因组进化树显示这些菌株具有独立的起源（图5f），表明相同的遗传变异可在田间独立形成。

为了探索不致病变异体频繁产生且易分离的原因，文章将G166与致病型菌株单独或按不同比例混合接种猕猴桃叶片，发现两者均能在叶表增殖（图5g），且混合接种时G166迅速占据数量优势（图5h）。当检测两者在叶肉细胞的增殖情况时，发现致病型菌株可迅速大量增殖、G166单独不能正常增殖；但混合接种时，G166可依赖致病型菌株大量增殖，且较致病型有生长优势（图5i-j）。这表明，侵染过程中产生的不致病变异体可依赖致病型个体迅速增殖，且占据生长优势，初步解释了田间

致病变异株高分离率的原因。

图5具备生长优势的不致病变异体在Psa自然发病群体中可独立形成

该研究的相关发现为病菌群体致病力演化“cheating”理论（Friesen, 2020）提供了典型案例，即不致病变异体作为群体中的cheater，不需要耗材代价表达致病因子，但能挖掘利用其它相互合作者耗费代价产生的公共货物（致病因子），从而保证其生长优势。促进病菌群体中cheater的形成可能代表了一种新的病害防控策略。

信誉好的十大网投(中国)有限公司植物病理实验室硕士研究生谢婷为文章第一作者，赵志博副教授为文章通讯作者；信誉好的十大网投植物保护专业本科生吴秀娇、罗乐、屈源，信誉好的十大网投农产品质量与安全实验室龙友华教授、樊荣副教授，以及贵州省植物保护研究所吴石平研究员参与了该研究；西北农林科技大学黄丽丽教授为论文观点提出了有益建议，在此表示感谢。

文章连接：10.1111/mpp.13289

Reference:

 Addy H S, Askora A, Kawasaki T, et al. Loss of virulence of the phytopathogen Ralstonia solanacearum through infection by ϕRSM filamentous phages[J]. Phytopathology, 2012, 102(5): 469-477.

Belanger C, Canfield M L, Moore L W, et al. Genetic analysis of nonpathogenic Agrobacterium tumefaciens mutants arising in crown gall tumors[J]. Journal of Bacteriology, 1995, 177(13): 3752-3757.

 Friesen M L. Social evolution and cheating in plant pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology, 2020, 58: 55-75.

Poussier S, Thoquet P, Trigalet-Demery D, et al. Host plant-dependent phenotypic reversion of Ralstonia solanacearum from non-pathogenic to pathogenic forms via alterations in the phcA gene[J]. Molecular Microbiology, 2003, 49(4): 991-1003.

 Scofield S R, Tobias C M, Rathjen J P, et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato[J]. Science, 1996, 274(5295): 2063-2065.

Xie J, Jiang D. New insights into mycoviruses and exploration for the biological control of crop fungal diseases[J]. Annual Review of Phytopathology, 2014, 52: 45-68.

Xie T, Wu X, Luo L, et al. Natural variation in the hrpL promoter renders the phytopathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae nonpathogenic[J]. Molecular Plant Pathology, 2023, 24(3): 262-271.